GST瓊脂糖凝膠說(shuō)明書
Glutathione-Triethyleneglycocyl-Sepharose 6B
目錄號(hào):K0190
保存:20%乙醇中2-8 ℃保存
組分說(shuō)明
Cat.No. K0190 K0190A
Volume 2ml 10ml
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
本產(chǎn)品為基于三甘醇(16 原子間隔臂)的谷胱甘肽瓊脂糖,可快速、溫和, 特異性地純化包含谷胱甘肽結(jié)合序列的非變性蛋白質(zhì),如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等,尤其適用于在大腸桿菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺育動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的GST 融合表達(dá)蛋白。該填料具有很好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性,使用壽命長(zhǎng),使用方便,批次重復(fù)性好,可一步分離得到純度較高的目標(biāo)蛋白,純化條件溫和,可以保證蛋白的活性。
載量:5-10mgGST 標(biāo)簽蛋白/ml 填料
支持物:CL-6B 瓊脂糖凝膠
粒徑:50-160 μm
注意事項(xiàng)
1. 請(qǐng)勿將GST凝膠冷凍、干燥和離心,整個(gè)純化過(guò)程中切忌凝膠脫水變干。
2. 蛋白層析應(yīng)使用高純度的試劑和水,層析前緩沖液應(yīng)用 0.45µm 濾膜過(guò)濾后使用。另外為防止柱子阻塞,上柱前建議將裂解液進(jìn)行離心,或者使用0.45µm 濾膜過(guò)濾。
3. GST 融合蛋白與還原型谷胱甘肽的結(jié)合比較緩慢,為獲得zui大結(jié)合量,上樣流速建議為:0.2-1ml/分鐘 (6ml 層析柱),0.5-2ml/分鐘(12ml 層析柱)。對(duì)于吸附效果不好的樣品,可以先把介質(zhì)和樣品混合,輕輕振搖 2-4 小時(shí),再裝柱,用平衡緩沖液進(jìn)行重新平衡、洗脫等操作,另外在細(xì)菌抽提試劑中添加 5mMDTT,可以顯著提高 GST 標(biāo)簽結(jié)合能力
4. 不同的GST融合蛋白取得zui佳純化效果所需還原型谷胱甘肽濃度、洗脫體積和洗脫時(shí)間可能有所不同。必要時(shí)需對(duì)流穿液、洗脫液進(jìn)行 SDS-PAGE 以及 Western 雜交分析,以確定zui佳純化條件。
5. GST 融合蛋白以包涵體形式存在時(shí)不能與介質(zhì)結(jié)合,必須先進(jìn)行變性、復(fù)性、透析處理后才能用介質(zhì)進(jìn)行純化。建議優(yōu)化蛋白表達(dá)條件盡量使蛋白可溶性表達(dá)。
6. 如后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要除去洗脫液中還原型谷胱甘肽,可采用超濾或透析的方法。
自備儀器和試劑
紫外蛋白監(jiān)測(cè)儀、細(xì)菌蛋白抽提試劑盒、再生緩沖液1和再生緩沖液2
溶液配制
結(jié)合緩沖液(PBS):10mMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,140mMNaCl,2.7mMKCl,pH7.4
洗脫緩沖液:10mMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,140mMNaCl,2.7mMKCl,10mM還原型谷胱甘肽(GSH),pH7.4。將0.1g還原型谷胱甘肽(GSH)溶于30ml 結(jié)合緩沖液,或?qū)?.25g 溶于75ml 結(jié)合緩沖液中。
再生緩沖液 1(自備):0.1MTris-HCl,0.5MNaCl,0.1%SDS,pH8.5
再生緩沖液2(自備):0.1MSodiumacetate,0.5MNaCl,0.1%SDS,pH4.5
操作步驟
樣本制備
1. 收集菌體后,每100 mg 菌體(濕重)加1-5 ml 細(xì)菌蛋白抽提試劑(每1 ml 細(xì)菌蛋白抽提試劑中加入10 μl 蛋白酶抑制劑混合物),如有需要可以超聲裂解菌體。
注意:1) 當(dāng)提取物粘度高時(shí),建議加入DNaseI 和 Lysozyme。每1ml 細(xì)菌抽提試劑中加入1μlDNaseI( 1 , 0 0 0 U / m l ),2 μ l L y s o z y m e(50mg/ml),DNaseI 和Lysozyme 可單獨(dú)從我公司購(gòu)買,貨號(hào):Lysozyme(#K0887)、 DNaseI(K2090A),或直接從我公司購(gòu)買K0888 細(xì)菌蛋白抽提試劑盒,包含細(xì)菌蛋白抽提試劑、DNaseI、Lysozyme 和蛋白酶抑制劑混合物。
2)超聲過(guò)程中保持菌液處于冰浴中,超聲條件依賴于所使用的超聲儀功率,探頭種類,容器的大小形狀,需實(shí)驗(yàn)中自己摸索,應(yīng)避免連續(xù)超聲導(dǎo)致溶液過(guò)熱,可分成短時(shí)間,多次超聲,zui終以菌液變清即可。
2. 10,000 rpm,4℃離心15 分鐘,將上清轉(zhuǎn)移至新的已預(yù)冷的離心管中,然后用預(yù)冷的 PBS Buffer 重懸沉淀(每50 ml裂解液的沉淀加入3mlPBS)。
3. 分別取10μl 上清和沉淀懸液進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測(cè),以確定蛋白存在于上清或沉淀中。若目的GST 融合蛋白形成包涵體(不可溶蛋白),應(yīng)在純化以前以適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行溶解和重折疊。組裝層析柱
1. 將 GST-Agarose 填料混合均勻直至重懸,用吸管移取適量的填料至層析柱中。室溫靜置10 分鐘,待凝膠與溶液分層后,把底部的出液口打開(kāi),讓乙醇通過(guò)重力作用緩慢流出。
注意:1)填料的上層是乙醇保護(hù)液,將填料與乙醇一起混勻,以每 ml 填料純化 5-10mgGST 標(biāo)簽蛋白計(jì)算,取需要的填料與乙醇混合液加入層析柱中。
2)如果乙醇不流出,可以給柱子一個(gè)外力,例如用大拇指對(duì)柱口輕輕按壓一下,迫使乙醇流出。
3)本實(shí)驗(yàn)都是通過(guò)重力作用使溶液流出。
2. 加入 5 倍柱體積的去離子水洗滌,再用10 倍柱體積的結(jié)合緩沖液平衡,平衡結(jié)束后即可上樣。
注意:柱體積指的是填料的體積。
GST 融合蛋白的純化
1. 將層析柱的出口連接上紫外蛋白監(jiān)測(cè)儀,根據(jù)紫外蛋白監(jiān)測(cè)儀觀察 280nm 處的吸收值來(lái)監(jiān)控層析柱流出蛋白情況。
2. 上樣:將制備的蛋白樣品用結(jié)合緩沖液等體積稀釋后,加入到已平衡好的層析柱中,建議上樣流速為:0.5-1ml/min(6ml 層析柱),1-2ml/min(12ml 層析柱)。觀察 280nm 吸收情況并收集流穿蛋白。
注意:1)樣品在上柱前可以離心或 0.45μm 微孔濾膜過(guò)濾。或者使用本試劑盒中附帶的一塊篩板,使用時(shí)先將篩板加至填料的上層,該篩板可用于雜質(zhì)較多的蛋白的過(guò)濾,防止過(guò)多的雜蛋白堵塞柱子的作用。再將處理好的樣品負(fù)載上柱,但是篩板放入柱子后就不易取出。
2)通過(guò)控制加入的菌體裂解液的速度或流出速度來(lái)控制柱流速,流速過(guò)快會(huì)影響柱效。
3. 洗滌:使用10 倍柱體積的結(jié)合緩沖液過(guò)柱,洗滌雜蛋白,觀察 280nm 吸收情況并收集雜蛋白。建議洗滌流速為:0.5-1ml/min(6ml 層析柱),1-2ml/min(12ml 層析柱)。
注意:建議洗滌液中加入蛋白酶抑制劑終濃度為1mM,如蛋白酶抑制劑混合物,以抑制蛋白酶活性。
4. 洗脫:使用10-15 倍柱體積的新鮮配制的洗脫緩沖液過(guò)柱,洗脫目的蛋白,觀察 280 nm 吸收情況并收集目的蛋白。
建議洗滌流速為0.5-1ml/min(6ml 層析柱),1-2ml/min(12ml 層析柱)。
5. 蛋白檢測(cè):分別取等量的流穿液,洗滌液和目的蛋白洗脫液進(jìn)行 SDS-PAGE 以分析蛋白的層析情況。
6. 洗脫后,依次用3-5 倍柱體積的結(jié)合緩沖液和3-5 倍柱體積的去離子水洗滌填料,再用 2-3 倍柱體積的20%乙醇洗滌(乙醇要將填料浸沒(méi)),4℃保存。
柱再生
當(dāng)填料使用多次后,結(jié)合效率會(huì)有下降,可用以下方法再生,提高填料的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。
1. 使用 5 倍柱體積的再生緩沖液 1 洗滌填料,而后用5-10 倍柱體積超純水洗滌。
2. 使用 5 倍柱體積的再生緩沖液2 洗滌填料,而后用5-10 倍柱體積超純水洗滌。
3. 保存:使用2-3 倍柱體積的20%乙醇洗滌,將層析柱的頭尾密封后(乙醇要將填料浸沒(méi))4℃保存。
4. 再次使用時(shí)加入5 倍柱體積的去離子水將乙醇洗滌后,使用10 倍柱體積的結(jié)合緩沖液平衡填料,平衡結(jié)束后即可上樣。
問(wèn)題與方法
1. 蛋白產(chǎn)量低
原因:
a低表達(dá)量
b融合蛋白為包涵體
c裂解不充分
d融合蛋白與介質(zhì)結(jié)合能力差
e流速過(guò)快
解決方法:
a優(yōu)化表達(dá)條件
b優(yōu)化細(xì)菌培養(yǎng)條件(如:降低溫度,改變誘導(dǎo)條件) c充分裂解細(xì)胞
d融合的伴侶蛋白改變了GST 空間構(gòu)象,影響了結(jié)合能力。純化前,在細(xì)菌蛋白抽提試劑中添加5mMDTT,可以顯著提高GST 標(biāo)簽結(jié)合能力。
e降低上樣樣品流速
2. 蛋白純度低
原因:
a洗滌不充分
b融合蛋白樣品中含其他細(xì)菌蛋白
解決方法:
a增加洗滌量:在洗滌液中中添加0.05%NP-40 或提高鹽濃度。
b純化前,在細(xì)菌蛋白抽提試劑中添加5mMDTT,減少非特異性吸附。
3. 柱流速緩慢
原因:
柱超載
解決方法:
降低樣品上樣量或流速
4. 柱壓力過(guò)高
原因:
細(xì)胞碎片堵柱
解決方法:
離心樣品,或用0.45μm濾膜過(guò)濾
實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):
| |||
| |||
| |||
| |||