業(yè)執(zhí)照.jpg)
磷脂酶 A2（phospholipase A2，PLA2）試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義
磷脂酶A2（EC3.1.1.4）是磷脂sn-2位脂?；饷?，廣泛存在于動(dòng)植物組織、細(xì)菌、細(xì)胞核分泌物中，參與脂肪消化，精子成熟、細(xì)胞信號(hào)傳遞、脂質(zhì)過(guò)氧化修復(fù)、宿主反應(yīng)等生理過(guò)程，在控制體內(nèi)磷脂類(lèi)物質(zhì)平衡、調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝、參與疾病的病理進(jìn)程等方面發(fā)揮著及其重要的作用。
測(cè)定原理
磷脂酶A2作用于2-硫代十六酰乙基磷酸膽堿（HEPC）產(chǎn)生游離巰基，與DTNB反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，在412nm處有特征吸收峰。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器
天平、超速冷凍離心機(jī)、研缽、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板。
試劑組成和配制
提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：液體 20mL×1 瓶，4℃保存。
試劑三：液體×5 瓶，-20℃避光保存。臨用前根據(jù)用量每瓶加入 1.8mL 試劑二充分混勻。(3天使用完)
樣品處理
1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于 4℃，10000g 離心5min，取全部上清于4℃、100000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。
2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后于4℃，10000g 離心5min，取全部上清于4℃、100000g 離心 30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。
3. 血清：直接測(cè)定。
測(cè)定操作
對(duì)照管 | 測(cè)定管 | |
樣品（μL） | 20 | 20 |
試劑二（μL） | 180 | |
試劑三（μL） | 180 | |
充分混勻，37℃反應(yīng) 10min，于微量石英比色皿/96 孔板，蒸餾水調(diào)零，測(cè)定 412nm 處吸光值，記為 A 對(duì)照管和 A 測(cè)定管，△A=A 測(cè)定管- A 對(duì)照管 | ||
計(jì)算公式
a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1．按照蛋白濃度計(jì)算
酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
PLA2 活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（ε×d）×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T
= 73.53×△A÷Cpr
2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活性定義：每克組織每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
PLA2 活性（nmol/min/g）= △A÷（ε×d）×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T
= 73.53×△A÷W
3. 細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活性定義：每104個(gè)細(xì)胞每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力
單位。
PLA2 活性（nmol/min/104cell）= △A÷（ε×d）×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總）÷T= 73.53×△A÷細(xì)胞數(shù)量
4 按照液體體積計(jì)算
酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
PLA2 活性（nmol/min/mL）= △A÷（ε×d）×V 反總÷V 樣÷T= 73.53×△A
ε：TNB 消光系數(shù)，13600L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)總體積，1mL；V 樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.1mL；W：樣本質(zhì)量，g；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10min
b. 用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1．按照蛋白濃度計(jì)算
酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
PLA2 活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（ε×d）×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T
=147.06×△A÷Cpr
2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活性定義：每克組織每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
PLA2 活性（nmol/min/g）= （ε×d）×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T
= 147.06×△A÷W
3. 細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活性定義：每104個(gè)細(xì)胞每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
PLA2活性（nmol/min/104cell）= △A÷（ε×d）×V 反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T=147.06×△A÷細(xì)胞數(shù)量
4 按照液體體積計(jì)算
酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
PLA2 活性（nmol/min/mL）= △A÷（ε×d）×V 反總÷V 樣÷T
= 147.06×△A
ε：TNB 消光系數(shù)，13600L/mol/cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V 反總：反應(yīng)總體積，1mL；V 樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.1mL；W：樣本質(zhì)量，g；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10min
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