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兔出血癥病毒elisa試劑盒

目的：本試劑盒用于測定兔血清，血漿及相關液體樣本中出血癥病毒抗體。本試劑僅供研究使用

實驗原理：
   本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定標本中兔出血癥病毒抗體。用純化
的兔出血癥病毒抗原包被微孔板，制成固相抗原，可與樣品中出血癥病毒抗體相結(jié)合，經(jīng)洗
滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后，再與 HRP 標記的兔出血癥病毒抗原結(jié)合，形成抗原-
抗體-酶標抗原復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成
藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），
與 CUTOFF值相比較，從而判定標本中兔出血癥病毒抗體的存在與否。
試劑盒組成：
試劑盒組成 48 孔配置 96 孔配置 保存
說明書 1 份 1 份
封板膜 2 片（48） 2 片（96）
密封袋 1 個 1 個
酶標包被板 1×48 1×96 2-8℃保存
陰性對照 0.5ml×1 瓶 0.5ml×1 瓶 2-8℃保存
陽性對照 0.5ml×1 瓶 0.5ml×1 瓶 2-8℃保存
酶標試劑 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
樣品稀釋液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
顯色劑A 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
顯色劑B液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
終止液 3ml×1 瓶 6ml×1 瓶 2-8℃保存
濃縮洗滌液 （20ml×20 倍）×1 瓶 （20ml×30 倍）×1 瓶 2-8℃保存
樣本處理及要求：
1.  血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上
清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。
2.  血漿：應根據(jù)標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心
20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次
離心。
3.  尿液：用無菌管收集，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程
中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4.  細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/
1

分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞
濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分
鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
5.  組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?br />用。標本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或勻漿器
將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待
檢測，其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上
進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
7.  不能檢測含NaN3的樣品，因 NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟：
1. 編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照2 孔、陽性對照2 孔、空白對照1
孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）
2. 加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照 50μl。然后在待測樣品孔先
加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測樣品 10μl。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不
觸及孔壁，輕輕晃動混勻，
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。  
4. 配液：將30（48T的 20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此
重復 5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同 3。
8. 洗滌：操作同 5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
15分鐘
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止
液后 15分鐘以內(nèi)進行。
結(jié)果判定：
試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00; 陰性對照平均值≤0.15
   臨界值（CUT OFF）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.20
   陰性判定：樣品OD值< 臨界值（CUT OFF）者為兔出血癥病毒抗體陰性
   陽性判定：樣品OD值≥ 臨界值（CUT OFF）者為兔出血癥病毒抗體陽性
注意事項
1．操作嚴格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用。
2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未
用完，板條應裝入密封袋中保存。
3．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
4．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
5．底物請避光保存。
6．試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準，使用雙波長檢測時，參考波長為630nm
7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。終止液為 2M 的硫酸，使用時必須
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注意安全。
保存條件及有效期
1．試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個月